De nouveaux outils optiques pour développer les modèles biologiques de demain

20/10/2018
Auteurs : Vincent Studer
Publication REE REE 2018-4
OAI : oai:www.see.asso.fr:1301:2018-4:23815
DOI :

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De nouveaux outils optiques pour développer les modèles biologiques de demain

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13 Z REE N°4/2018 LES GRANDS PRIX 2017 DE LA SEE Que ce soit pour mettre au point les médicaments de demain, pour éva- luer la toxicité d’un nouveau composé ou pour mieux comprendre le fonc- tionnement du vivant, il est aujourd’hui impossible de se passer des tests onneme pos du vivant, il r animaux. En effet, les expériences réalisées sur des cellules cultivées sur an sées s effet, les expérie classiquement dans des boîtes de Petri ne reproduisent pas assez fidèlement cla roduisen es boîtes de Petri n les mécanismes du vivant pour pouvoir offrir une alternative crédible. Ce r une alt vant pour pouvoir paradigme est néanmoins en train d’être bousculé. La découverte par Shinya re b culé. La dé s en train d’être Yamanaka et ses collègues d’une méthode permettant de reprogrammer des éthode perm mettant de gram ’une méth cellules matures en cellules souches (IPSC), capables à leur tour de se diffé PSC), cap pables à le ur de les souc - rencier en n’importe quel type de cellule du corps humain, est une avancée u corp rps humai t une a type de cellule du co considérable en biologie et en médecine, récompensée par le prix Nobel en pensée e prix No n médecine, récomp 2012. Utiliser ces cellules souches issues d’un patient sain ou malade, les dif ient sain u malade, ssues d’un pat s - férencier et les organiser dans l’espace afin de recréer un modèle biologique éer un m modèle biol ace afin d pertinent d’un organe humain n’est plus du ressort de la science-fiction. De e la s science-fict plus du ressort de nombreux laboratoires dans le monde travaillent déjà sur la mise au point de l la mise au p de travaillent déjà sur la ces modèles biologiques de demain. Plusieurs stratégies ont été proposé ont é nt été p sées ieurs stratégies on pour y parvenir. La première voie est celle de la bioimpression qui consiste à impr iste à i primer en mpression 3D, les différents types cellulaires constitutifs de l’organe ou de l ou de e l’organoïde tutifs de l’organe (organe miniature in vitro capable de remplir une fonction biologique élé n bio ologique élé mplir une fonction bi - mentaire) en espérant ensuite que ces cellules soient capables de retrouver de retrouv es soient capables ce une cohésion suffisante pour recréer dans leur ensemble un processus bio proc ocessus nsemble un p ns leu - logique physiologique. Cette approche suivie notamment par la société amé r la so amé uivie notamm - ricaine Organovo paraît pertinente pour des structures relativement s tiveme ent simples es structures rela comme la peau, le foie ou le rein mais est pour l’instant peu eu e u envisageable pour l’instant peu es pour des organes plus complexe tels que le poumon ou le ce e erveau. umon ou le ce ue le Une seconde voie consiste à tenter de récapituler in vitro les grandes n vitro ro les grand tuler in v r de réc étapes de l’organogénèse en laissant les cellules partiellement différentiées ement s s cellules n (on parle de cellules progénitrices) proliférer, migrer, se différencier et s’auto- différen s’auto- érer, migrer, s s) p organiser. Cette seconde voie a très récemment donné des résultats très nné de es résultats très emment don a très prometteurs. M. Lancaster et ses collègues ont notamment réussi à cultiver me ment réussi à cultiv s ont notamm es collè te des organoïdes de cerveau humain à partir de cellules souches pluripotentes de souches pluripote e cellules s main à pa cerve duites issues de patients atteints de micro-encéphalie [1]. Ces « encépha indui halie [1]. Ces « ncéph eints de m e patie minicer- r r veaux » millimétriques présentent de nombreuses caractéristiques phénoty breuses ca é i ent de nom étriques - des cerveaux humains de ces malades lorsqu’on les compare avec lades lo piques d lades lorsqu’on les compare de ces mal erveaux hu us de patients sains. Néanmoins de nombreux efforts sont encore a ceux issu ns de nombreux efforts sont anmoins e patients s ires pour que ces mini-organes puissent récapituler des processus ces mini-organes nécessair s puissent récapituler de pour que c ogiques complexes. Durant l’organogénèse, de nombreux signaux phy biologiques complexes. Durant l’org biolo biologiq énèse de no plexes. Durant mplex - s et chimiques sont orchestrés dans le temps et dans l’espace pour es et chimiq siques ques sont orchestrés dan outir à un organe composé de multiples types cellulaires. In vivo, ces about ane composé de multiples typ signaux émanent aussi bien des cellules de l’organe que de leur proche ien des cellules Le Prix Jean Jerphagnon nore honore la mémoire et prolonge l’œuvre de e l’œuv prolonge émoir uvre de Jean Jerphagnon, décé décéd n décé n Jerpha cédé en 2005, qui mena une carrière remarquable arrière mena un e remarquable dans le domaine de l’optique et de ne de l s le doma de la photonique. Il a pour objectif de . Il a p hotonique. objectif de promouvoir l’innovation technolo nnov mouvoir l’in p novation technolo- - ique et la diffusion de l’optique diff et la dif giqu ffusion de l’optiqu e la photonique dans tout hoton et de l nique dans to out ne d’application. d’app domaine ion. age de reconnaissance, gnage En témoign ge de reconnaissa plusieurs structures se sont associées tru plusieurs str ructures se sont a o pour créer le Prix Jean Jerphagnon er le P our créer e Prix Jean Je phagn : Académie des technologi e des Acad ologies, l-Lucent, Centre national de ucent, Alcatel-Luc Centre national d e scientifique, France e s la recherche scientifique, Fra ce Télécom, Pôle de compétitivit e Télécom, Pôle e de compét vité Images et Réseaux, Associa Résea ges et R ociation Opticsvalley, Société des électriciens y, Socié Opt des électriciens s électroniciens, onicien et des électr s, Société française d’optique, Société frança ique, française d’optique Société fra çaise de physique, Pôle de compétitivit de physique, Pôle de compét vité Systématic-Paris-Région, Thales égion, T atic-Paris-R es. Vincent Studer Prix Jean Jerphagnon Directeur de recherche au CNRS, rche Institut Interdisciplinaire discip de Neurosciences à l’Univers ces à l’ ersité de Bordeaux Bordeaux V S De nouveaux outils optiques pour développer les modèles biologiques de demain REE N°4/2018 Z 14 microenvironnement [2]. De nombreux experts du domaine proposent de recréer in vitro les signaux du microenvironne- ment durant la genèse de l’organoïde. [3] Dans ce contexte, les technologies de micro-fabrication, héritées de la micro-électronique, ainsi que les avancées dans le domaine des biomatériaux offrent aujourd’hui des possibilités à explorer rapidement [3]. Pour cela, avec mes collègues, nous avons mis au point un nouvel instrument capable de recréer, in vitro et à façon, des microenvironne- ments synthétiques aux propriétés mécaniques et chimiques analogues à celles observées in vivo. Cet instrument utilise une lumière UV modulée spatialement pour générer des microstructures en polymères ou en hydrogels [4,5]. Ce même outil permet de fonctionnaliser par photochimie ces structures à l’aide de biomolécules (protéines) spatialement organisées (micropatterning) et impliquées dans l’organogé- nèse [4]. Cette plate-forme appelée PRIMO est aujourd’hui commercialisée par la société Alvéole (https://www.alveole- lab.com) basée à Paris qui exploite les brevets issus de notre laboratoire. PRIMO permet aux biologistes d’avoir accès aus- si simplement que possible à une palette de procédés de micro-structuration et de micropatterning pour leurs expé- riences de biologie cellulaire [6]. L’originalité du système PRIMO repose sur l’utilisation d’un DMD ou Digital Micromirror Device. Ce composant, initialement développé pour les systèmes de vidéo-pro- jection est constitué d’un réseau de micro-miroirs pouvant individuellement être orientés selon deux positions, sous le contrôle d’un ordinateur. Adapté à notre système, le DMD permet de créer des motifs d’illumination micrométriques de lumière UV « à la demande », facilement modifiables, projetés directement sur un échantillon via l’objectif d’un microscope (figure 1). Le DMD permet de générer des patterns de toute forme géométrique possible, et nous pouvons contrôler la dose d’UV reçue par chaque pixel du champ de vue indépendam- ment. Nous avons montré comment, à l’aide de ce système, la plupart des hydrogels utilisés en biologie cellulaire peuvent être photopolymérisés en leur ajoutant un photoinitiateur hydrosoluble tel que le PLPP d’Alvéole. L’éclairage UV struc- turé et collimaté de notre plate-forme permet de générer des motifs extrudés micrométriques d’hydrogels de forme contrôlée. Nous avons ensuite montré qu’en intercalant le mélange d’hydrogel non polymérisé et de photoinitiateur entre un substrat de verre et un film fin de silicone trans- parent et perméable au gaz, il était possible de contrôler la hauteur de polymérisation. En effet dans cette configuration, la polymérisation est inhibée par l’oxygène à proximité du film de silicone (PolyDiméthylSiloxane). L’épaisseur de cette zone “morte” résulte d’une compétition entre la puissance d’UV locale (qui fixe la concentration locale de photoinitia- teur activé) et la pression partielle d’oxygène. En ajustant la puissance locale à l’aide du DMD nous pouvons générer des structures 3D en plein champ (figure 2). LES GRANDS PRIX 2017 DE LA SEE Figure 1 : Représentation schématique du montage optique à l’origine de PRIMO. De nouveaux outils optiques pour développer les modèles biologiques de demain En s’appuyant sur la même plate-forme PRIMO, nous avons mis au point un procédé de greffage de biomolécules appelé LIMAP (Light Induced Molecular Adsorption of Proteins). L’ef- ficacité de ce procédé repose sur une chimie de surface effi- cace qui combine une adsorption non spécifique minimale et une forte réactivité à l’illumination UV, le tout permettant d’obtenir un ratio signal/bruit élevé. Les substrats classique- ment utilisés en biologie (verre, polystyrène), sont recouverts d’une couche de polyéthylène glycol (PEG) anti-adhésive pour la plupart des biomolécules. En réponse à l’illumination UV contrôlée via le DMD et en présence d’un photoinitiateur hydrosoluble, la brosse de PEG est localement dégradée, permettant l’adsorption de biomolécules spécifiquement là où le pattern de lumière a été projeté. Ces patterns de molé- cules représentent un îlot adhésif dans un environnement non adhésif. De façon très intéressante, il existe une relation quasi linéaire entre la dose d’UV localement projetée et la densité de protéines finalement adsorbée. Ajoutons que ce procédé peut être réitéré successivement avec des protéines et des motifs différents. La figure 3 représente le principe du LIMAP et la succession d’étapes pour générer une impression de deux protéines différentes. Très récemment nous avons réussi à modifier le procédé LIMAP jusqu’alors réservé à des matériaux anhydres pour le rendre compatible avec des structures en hydrogels [5]. En résumé avec une plate-forme unique il est maintenant REE N°4/2018 Z 15 Figure 2 : Schéma (vue en coupe) illustrant le contrôle de l’épaisseur de polymérisation d’un hydrogel par compétition entre le flux d’oxygène et le flux de photons UV. A gauche, sous argon, le gel polymérise de haut en bas. Au milieu, sous air la hauteur est contrôlée par le flux de photon. A droite, image en microscopie confocale de la structure d’hydrogel réalisée. Figure 3 : Principe du « Light-Induced Molecular Adsorption of Proteins ». A) En présence de photo-initiateur et de lumière UV, la brosse anti-adhésive est localement dégradée permettant l’adsorption de molécules sur la surface sous-jacente. Ce processus peut être répété pour adsorber une deuxième molécule. B) Image en microscopie à épifluorescence obtenue après incubation séquentielle de deux protéines, GFP (vert) et de mCherry (rouge) après projection des deux patterns de lumière montrés en A. 16 ZREE N°4/2018 LES GRANDS PRIX 2017 DE LA SEE possible de réaliser à façon et avec un débit important des microenvironnements artificiels pour la culture d’organoides (figure 4). Plus de 40 laboratoires dans le monde disposent au- jourd’hui du système PRIMO issu d’un transfert de techno- logie de notre laboratoire vers la société Alvéole. Un nombre important d’entre eux l’utilisent avec succès pour dévelop- per de nouveaux modèles biologiques à partir de cellules souches. Références [1] LancasterMA.,RennerM.,MartinC-A.,WenzelD.,BicknellLS., Hurles ME., Homfray T., Penninger JM., Jackson AP., Knoblich JA. Cerebral organoids model human brain development and microcephaly. Nature. 2013, 501(7467): 373-9. [2] V.Ruprecht,P.Monzo,A.Ravasio,Z.Yue,E.Makhija,PO.Strale, N. Gauthier, GV. Shivashankar, V. Studer, C. Albiges-Rizo, V. Viasnoff. How cells respond to environmental cues–insights from bio-functionalized substrates. (2016) J. Cell Science. [3] Jérémie Laurent, Guillaume Blin, François Chatelain, Valérie Vanneaux, Alexandra Fuchs, Jerome Larghero and Manuel Thery (2017) Convergence of microengineering and cellular self-organization towards functional tissue manufacturing. Nature Biomedical Engineering, vol. 1, no. 12, pp. 939-956. [4] Strale, PO., Azioune, A., Bugnicourt, G., Lecomte, Y., Chahid, M., Studer, V. (2016) Multiprotein Printing by Light-Induced Molecular Adsorption. Advanced Materials, 28, 2024–2029 [5] Pasturel A., Strale, PO., Studer, V. (2018) A generic widefield topographical and chemical photopatterning method for hydrogels. Bioarxiv preprint doi: https://doi. org/10.1101/370882 [6] Celine Stoecklin, Zhang Yue, Wilhelm W. Chen, Richard de Mets, Eileen Fong, Vincent Studer, Virgile Viasnoff. (2018) A new approach to design artificial 3D micro-niches with combined chemical, topographical and rheological cues. Advanced Biosystems, 1700237. L’AUTEUR Vincent Studer est directeur de recherche au CNRS à l’Institut Interdisciplinaire de neurosciences à l’Univer- sité de Bordeaux. Expert en microscopie et en micro- engineering pour les sciences du vivant, il est co-auteur de plus de 30 articles dans des revues scientifiques et a déposé plus d’une dizaine de brevets. Il est notam- ment à l’origine de la création de la société Alvéole (www.alveolab.com) qui commercialise une impri- mante à biomolécules inventée à l’IINS. Il est lauréat de la médaille de bronze du CNRS en 2013 Figure 4. Gauche : Explant de neurones d’embryon de poulet poussant sur un motif imprimé de laminine (en vert). Milieu et droite: sphéroïdes de cellules cultivées dans des structures cylindriques d’hydrogel, quelques minutes après l’ensemencement (milieu) et après 24 h (droite).